学术活动
研究工作
作者:管理员 来源:本站 浏览数:3244 发布时间:2010/6/20 21:23:33

本实验室各方向研究工作包括

1.纤维素酶基因克隆及其重组高效表达研究

木质纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源,全球每年由光合作用产生的木质纤维素总量约为1000亿吨。木质纤维素主要由纤维素(约40%)、半纤维素(约30%)和木质素(约20%)组成。目前在世界范围内对木质纤维素资源的综合利用还相当有限。如果能够在技术上有所突破,充分利用木质纤维素资源,就可以缓解世界范围内日益突出的粮食和能源短缺问题,产生巨大的社会和经济效益。

纤维素酶具有水解木质纤维素的能力,通过纤维素酶中三种组分(内切β-1,4-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶) 的协同作用可以将纤维素水解为葡萄糖。纤维素酶在木质纤维素资源综合利用中的作用日益受到重视。此外,纤维素酶还在纺织品水洗、饲料添加剂、加酶洗涤剂等行业具有应用前景。

本小组在纤维素酶基因克隆和重组高效表达方面近两年开展的主要工作有:

[1] 里氏木霉中两种纤维素酶组分CBHⅡ和EGⅣ的重组表达

克隆了里氏木霉酸性纤维素酶系中的内切酶基因egl Ⅳ和外切酶基因cbh Ⅱ,分别构建了含有上述基因的毕赤酵母重组工程菌,在工程菌中成功表达了上述基因,对转基因高产菌株进行了筛选,对产酶发酵条件进行了研究。以羧甲基纤维素钠为底物,EGⅣ的酶活力检测的结果为2.21 U/ml,CBH II的酶活峰值为3.46 IU/mL。

[2] 嗜碱性纤维素酶的重组表达

克隆了芽孢杆菌KSM-635碱性纤维素酶E-L基因,将其在毕赤酵母中表达。该基因表达的蛋白为103kD,酶的最适pH值为9.5左右,其活性可以长期稳定在pH6-11的范围内,最适温度为40。以羧甲基纤维素钠为底物,振荡培养条件下的产酶活性为25U/ml,初步具备用于工业化生产的潜力。

[3] 嗜碱性纤维素酶产生菌的筛选鉴定

筛选到产碱性纤维素酶活力高的革兰氏阴性菌H8005,同时筛选到高产的芽孢杆菌C3004液体振荡培养产生碱性CMC酶活力分别为45.1U/mL和46.6U/mL。H8005和C3004的CMC酶反应的pH值分别以8.0和7.0左右为适;在碱性条件下均具有较高的酶活性和一定的pH值稳定性;反应温度分别以55℃和50℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。在棉织品的水洗整理及洗涤剂工业中具有良好的应用前景。

另外,本研究小组还进行了植物SR蛋白激酶(SRPK)和SRPK相关蛋白的研究工作。SR蛋白serine/arginine-rich proteins)富含丝氨酸-精氨酸二肽重复序列,是剪接小体(spliceosome)的重要组分。SR蛋白激酶(SR protein kinaseSRPK是特异性催化SR蛋白使其磷酸化的激酶。1994年, Gui等发现第一种SR蛋白激酶:人培养细胞SRPK1。其后,小鼠SR蛋白激酶mSRPK1mSRPK2、线虫SR蛋白激酶SPK-1、芽殖酵母SR蛋白激酶Sky1、原生动物SR蛋白激酶TcSRPK等陆续被发现。迄今关于SRPK的工作集中在动物细胞中,尚未见到有关酵母以外的植物细胞的研究报道。我们以低等植物多头绒泡菌为材料,克隆了新的SRPK基因,对多头绒泡菌SRPK相关蛋白SC35进行了研究。正在采用酵母双杂交和RNAi等方法寻找SRPK相关蛋白研究SRPK和SRPK相关蛋白的功能。

2.过敏性疾病变应原疫苗及诊断试剂的研制及产业化

[1] 过敏性疾病变应原的应用基础研究

过敏性疾病变应原的组织化学和抗原定位研究:运用体视学、免疫组化、免疫荧光等技术,对本室纯培养的屋尘螨、粉尘螨、美洲大蠊、德国小蠊等进行了形态学观察和特异性抗原定位研究。为变应原疫苗的制备奠定了理论基础。

天然变应原的分离、鉴定、纯化和质谱分析:对我国数十种常见变应原(吸入性变应原和食入性变应原)进行了分析、鉴定和纯化,为下一步变应原诊断试剂和变应原疫苗的研制奠定了坚实基础。

尘螨、花粉、真菌、蟑螂变应原的cDNA文库的构建以及重组变应原基因的克隆、高效表达、纯化和免疫学特性鉴定:构建了国际上首个“蒿属花粉”、“美洲大蠊若虫”、“枝孢芽枝菌”cDNA文库,以及国内首个“尘螨”cDNA文库,并筛选到数十个阳性克隆。目前已有数个重组变应原阳性克隆基因序列在GenBank登录(AF314962314963等)。率先在国内对屋尘螨Der p1Der p2,粉尘螨Der f1Der f2,美洲大蠊Cr pICr p7,德国小蠊Bla g2,蒿属花粉Art a1基因进行了克隆、表达及纯化。

变应原的质量标准的研究和制定:在国内率先开展了尘螨变应原疫苗的质量标准的研制工作,目前正在与国家药品监督管理局中国药品卫生检定所开展合作,共同制定中国尘螨变应原疫苗质量标准。

变应原哮喘动物模型的建立以及变应原免疫治疗机理的研究:利用重组Der p2变应原成功建立小鼠变态反应气道炎症动物模型,为研究支气管哮喘发病机理与治疗方法提供新的手段。并首次将卵清蛋白(OVA)与纳米粒子进行偶联(图12),探讨了变应原纳米疫苗免疫治疗作用机理

[2] 尘螨变应原疫苗的研制及产业化:

解决尘螨的大规模纯培养、可溶性培养基、纯化工艺以及Der p1、Der p2的高效表达与纯化等工艺问题。深圳天大药业股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、深圳新鹏生物技术有限公司均对尘螨变应原疫苗的研制及产业化有合作意向,预计年底前后将与其中某一生物制药企业正式签约,有望明年底申报SFDA新药临床批文。

[3] 过敏性疾病变应原诊断试剂的应用基础研究(过敏性疾病变应原蛋白芯片诊断试剂盒的研制及产业化)

用基因工程和蛋白芯片技术,对我国数十种常见变应原进行分析、纯化、抗原修饰、标准化以及变应原蛋白芯片研制和临床应用研究。率先研制出具有自主知识产权和具有中国区域特色的过敏性疾病变应原蛋白芯片诊断试剂盒,将填补国内外该领域产品的空白,必将产生良好的社会效益和显著的经济效益,对振兴我国高科技生物医药工业,推动国民经济发展有着重要意义。该项目2003年在第五届深圳高新技术产权交易会上与深圳欣康基因数码科技有限公司正式签定了合作协议书(合同金额:1500万元,其中研发经费40万元已到位),预计2005年将研制出国内外第一张过敏性疾病变应原蛋白芯片,并将开展临床应用研究。

[4] 空调灰尘尘螨过敏原检测与空调防螨技术的研究

空调过滤网灰尘中存在大量的尘螨。空调中生存的尘螨及其分泌物、排泄物、死亡后的降解产物等尘螨过敏原,可能随空调送风而排进室内(相关密闭的空间)使人们致敏,从而导致哮喘等过敏性疾病发病率上升。本研究通过研制新一代防螨健康空调和除螨吸尘器,将能最大限度地消除室内生物性污染,创造一个健康的室内环境。

3.植物抗逆基因的克隆及转基因植物的生产

干旱、盐渍、土壤沙化是影响农业生产与生态环境的最重要因素。培养抗旱耐盐作物、提高林木、牧草的耐旱性,是解决上述问题的有效途径。到目前为止,利用常规方法尚未培育出真正的抗旱品种。植物抗旱分子机制研究的不断深入和转基因技术的日趋完善,为培育高效植株新品种开创了一条崭新的途径。这对于提高作物产量,防沙治沙,加强生态建设和可持续发展,开发利用盐碱滩涂地,特别对解决我国西部地区干旱农业问题,有着十分重要的意义。

近年来,国内外一些实验室开展了植物抗旱耐盐分子机制的研究工作。相继克隆到抗旱耐盐基因。将其通过转化水稻,使水稻的抗旱耐盐性得到了明显的改善。但到目前为止,还未见大规模、商业化生产抗旱转基因植物(如作物、树木、草、花卉)的报道。本课题组在收集大量抗旱耐盐植物材料的基础上,在研究抗旱耐盐生理生化反应特性之后,开展了抗旱耐盐基因克隆的研究工作。我们已获得了几个抗旱耐盐基因,初步验证了他们在原核细胞中的耐盐功能。在将基因导入烟草植株中以后,验证了转基因烟草的耐盐特性得到了增强和改善。

[1] 获得4个抗旱耐盐基因

利用大肠杆菌功能筛选法,从大豆cDNA文库中筛选出1个耐盐菌株,其中含有ALU蛋白基因,即基因1。采用PCR法,从大豆cDNA文库中扩增出2个抗旱耐盐相关基因,即基因2和基因3。通过对DNA序列进行分析,选定了耐盐功能区,以此构建了1个耐盐耐旱融合基因,即基因4。

[2] 4个抗旱耐盐基因在原核细胞中具有较好的耐盐、耐碱和耐低温功能

首先将这4个基因转化大肠杆菌,获得了4种大肠杆菌转化子。在大肠杆菌培养液中加入一定浓度的IPTG,以诱导大肠杆菌细胞中载体插入的外源基因的表达。通过SDS-PAGE电泳及质谱分析,证明大肠杆菌的载体插入的外源基因可以表达出目的蛋白。

将这4种大肠杆菌转化子的培养液涂布在高盐培养基上,通过观察和检测大肠杆菌转化子在高盐培养基中的生长状况,对4个抗旱耐盐基因的耐盐功能进行快速鉴定。结果说明菌株均有较好的抗盐、耐碱和耐低温性。

[3] 4个抗旱耐盐基因在转基因烟草植株中具较好的耐盐功能。

4个基因分别转化烟草。采用叶片圆盘法,用农杆菌侵染法将外源基因导入烟草细胞内。获得转基因烟草植物。通过提取转基因烟草叶片的DNAPCR反应,证明了导入的外源基因已经整合到烟草植株的基因组DNA中。通过反转录PCR技术,证明了外源基因在烟草中得到了表达。我们配制了含盐培养基,鉴定这些转基因烟草在含盐培养基上的生长状况。结果显示,转基因烟草比其对照株表现出了较好的耐盐性。抗逆转基因植株已达30余株。

4.藻菌生物技术与水环境生物学研究

 本研究方向主要研究环境微生物(包括细菌和藻类等)的生理生态特性、分子生物学机理及其在医药和工农业生产中的应用技术;同时对水环境的污染控制与生态修复工程理论与技术体系进行深入研究。

DNA重组技术是二十世纪七十年代在大肠杆菌表达系统中发展起来的。随着现代分子生物学技术的不断发展完善,外源基因的高效表达已经成为基因工程制药、基因诊断与治疗、现代农业和工业原材料生产的重要生物技术手段。研究开发出适应不同技术需求的各种外源基因高效表达系统已经成为现代生物技术的热点问题。

目前比较成熟的几个外源基因表达系统虽然都有其各自的优势,但仍然存在各种不足:如大肠杆菌表达系统虽然表达量大,但产物大多以包涵体形式存在,且不能进行糖基化修饰;酵母表达系统解决了真核基因的产物糖基化问题,但也存在甲醛诱导物的毒性、产物乙醇累积及发酵底物的高成本等问题;高等植物表达系统能利用植物光合作用产物作为生产外源蛋白的底物,但其生产周期长,占地空间大。于是人们想到利用藻类作为外源基因表达系统来表达外源蛋白。因为藻类既能象高等植物一样进行光合作用,解决发酵底物问题,又能象细菌一样进行集约化生产。目前比较成熟的藻类外源基因表达系统是蓝藻表达系统,但蓝藻属于原核生物,同细菌一样不能进行真核基因表达产物的糖基化修饰。本课题组构建的莱茵衣藻外源基因表达系统是集中了细菌、高等植物双重优势的新型真核外源基因表达系统。

莱茵衣藻属于绿藻门、团藻目、衣藻科,是一种单细胞真核鞭毛藻类,是研究多种生命活动(如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等)的模式生物,与酵母细胞有许多共同的特征,素有“光合酵母”之称。它的遗传背景清楚,其基因组学研究已近完成,是目前唯一建立细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传转化系统的生物材料。由于其生长速度快、光合效率高、可进行基因定点整合,是最适合构建转基因光合生物反应器的单细胞真核生物,具有非常广阔的应用前景。但目前最大的限制因素就是莱茵衣藻外源基因表达调控机理问题。本研究方向将重点研究莱茵衣藻外源基因表达调控机理与调控技术体系,构建高效转基因衣藻生物反应器,并应用于医药、保健食品、生物化工材料等领域。

随着我国社会经济的高速发展,环境污染日益严重,我国85%的自然水体已遭到不同程度的富营养化污染,致使自然水体生态修复工程成为具有巨大经济潜能的新兴产业。湖泊、水库、池塘和各种人工水体的生态修复问题已成为环保领域的热点和难点问题。本课题组自1999年开始从事蓝藻水华控制与生态修复方面的研究,与中国科学院水生生物研究所、香港城市大学等单位合作,先后参与蓝藻控制与生态修复工程项目,建立了一整套安全可行的自然水体生态修复技术体系。特别是在富营养化水体中藻菌关系、种群动态、细菌生理生态特性转换和水华暴发机理等方面进行了系统的研究。本课题组将在水污染控制和生态修复的理论与技术体系方面开展工作。

 

本研究方向主要研究内容包括

[1] 构建微藻的外源基因高效表达系统,通过转基因藻生产可食性疫苗、药用蛋白、色素、生物可降解塑料等,在环保、医药、食品以及饵料工业等领域进行应用开发研究。

[2]研究富营养化水体中水华藻类和细菌的相互关系,探讨藻类水华形成的机理和富营养水体生态修复的途径与方法;自然水体中藻毒素及有毒藻类快速检测与控制技术体系。

[3] 研究水环境中藻类、细菌次生代谢产物的分离、生物合成、相关基因克隆与表达调控;利用藻类和细菌集约化培养技术,进行天然药物、食品添加剂、活体饵料等产品开发。

近年来的主要研究进展有:

[1] 采用Chlamydomonas reinhardtii cc-849作为受体生物,以增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,以莱茵衣藻1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基(RBCS2)编码基因的启动子(740bp)和RBCS2终止子(231bp)组成的p105为基础载体,在转录水平上对莱茵衣藻外源基因表达调控进行了研究,构建了一个能将转化效率提高8倍和表达水平提高2.5倍的高效表达载体pH105,并在此基础上建立了一套莱茵衣藻高效表达系统和调控技术方法。将该表达系统应用到用于废水处理的转MT-like基因衣藻和用于生产生物可降解塑料(PHB)的转phbBphbC基因衣藻获得了较理想的结果,为将莱茵衣藻外源基因表达系统建成一个高效的转基因生物反应器,并应用到医药、食品和工农业生产的各个领域打下了良好的基础。

[2]发现了自然水体中藻类水华动态变化与自然水体中细菌VIVIFORM状态之间存在直接的相关性。通过人为改变自然水体中蓝藻毒素水平,发现微囊藻毒素可以诱导细菌从VIVIFORM状态转化成可培养细胞。

[3] 开展了深圳自然水体藻毒素水平和产毒藻类动态分布情况调研及富营养化湖泊稳态转化过程中细菌的生理生态特性及种群动力学规律的研究。建立了自然水体中检测有毒藻类和藻毒素的快速分析体系,研制了基于PCR技术的有毒藻类分子检测试剂盒和基于ELISA技术的藻毒素检测试剂盒,并建立了的实用性应用方法与程序.

[4] 构建了用于外源基因高效表达的衣藻表达载体(p124S105、pHSP124等),并高效表达了MT-like、phbB、phbC、GFP、KK等基因,开展了表达体系的基因调控和技术规范研究。

[5] 从念珠藻、雨生红球藻和微囊藻等微藻中分离纯化了抗癌药物—隐藻素、高效抗氧化剂—天然虾青素和微囊藻毒素等次生代谢产物,并进行了相关次生代谢产物的生物合成和基因调控方面的研究。

 

 

从地球生命起源进化到现在的高等哺乳动物均是在地磁场中进行的,生物和磁场有着千丝万缕的联系,零磁空间是有害的,磁场作为一种理疗手段人们越来越发现它的益处,但强磁场对环境的影响,对生物的影响,尤其是对人体的影响,均是值得关注的问题。根据我们对磁场的多年研究和大量的文献总结,磁场对生物体的作用并不是简单的物理过程,在不同强度、不同时间、针对不同的细胞或组织会产生完全不同的效果。磁场作为环境因子,可以影响细胞之间的信号传递物质,如递质、激素、神经肽等,从而影响其靶细胞的功能。磁场还可以影响细胞的分裂周期,抑制某些细胞凋亡,但磁场的这些作用是具有可逆性的。为此要严格的摸清楚磁场强度和作用时间及最合适的安全窗口,从而科学的应用磁场,达到趋利避害的目的。

2002年以前,我们主要研究了各种磁场对原生动物细胞分裂增殖的影响、对细胞膜稳定性的影响、并做了磁场抑制肿瘤细胞增殖影响、磁场对止吐和止痛机理等多方面的研究。确立了用于磁疗的最佳磁场形式-旋转恒定强磁场,确立了磁疗的最佳强度和时间,并研制了高速旋磁治疗装置。在重点实验室建立以后至今,我们主要研究了磁场治疗骨质疏松的机理,承担了国家自然科学基金项目“4T以下恒磁场对生物体生理功能正负影响的系统研究”。现在已完成4T超导恒定强磁场对大鼠急性毒性作用的研究、旋转强恒磁场对大鼠生殖毒性的探索、旋转强恒磁场对孕鼠子代生化指标影响的研究、为磁疗的广泛推广打下坚实基础。完成磁场对治疗骨质疏松机理的研究,并作了磁场对RAW264.7细胞株向破骨细胞分化及凋亡的影响,和对兔破骨细胞破骨能力的影响,从细胞水平阐明了磁场对治疗骨质疏松机理。已完成旋转强恒磁场治疗失眠机理的研究,还对磁场对血脂影响作了初步的探索。现正在进行磁场对股骨头坏死治疗作用和机理研究,并已获得初步结果,现正在进行临床实验,发现对SARS后遗症股骨头坏死患者的治疗中,已明确对Ⅰ,Ⅱ期有明确疗效。除上述工作外,还开展了磁场对血液系统影响的研究工作。

我们正在进行旋转恒定磁场对股骨头坏死治疗作用的研究,并申报了深圳市科技基金支持。同时我们和天津血液病研究所合作的旋转恒定磁场对骨髓系统增殖分化影响的研究项目也已经展开。以后我们的主要任务就是要把磁场治疗作用的机理尽可能的阐明,为磁疗事业开拓一片广阔的天地。

5.磁生物学研究